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當前位置:水產資料 → 適度的低溫孵育可改變魚 今天是:2019年11月15日 星期五

五码直选复式方法:適度的低溫孵育可改變魚類神經壞死病毒表面突起和游離外殼蛋白構象結構

出處:公眾號水生動物健康評估 作者:南湖意 水產養殖網 2019-11-06 11:24:00

論文解讀:Scientific Reports,適度的低溫孵育可改變魚類神經壞死病毒表面突起和游離外殼蛋白構象結構。

今天小編給大家分享一篇文章,引用信息如下:
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神經壞死病毒(NNV)是Nodaviridae病毒科,Betanodavirus病毒屬的一種,可感染120多種魚類,在世界范圍內的水產養殖中造成高死亡率。目前已開發出多種NNV疫苗,其中許多可產生NNV中和抗體。近年來,已開發出有效的方法來誘導NNV感染后的魚類恢復。有趣的是,在這些恢復期的魚身上無法檢測到NNV中和抗體,盡管這些魚有很強的?;ぷ饔?,不受NNV的再次感染。這表明,失活的NNV顆粒和自然的NNV顆粒在抗原性上可能存在一些細微的差異。
利用病毒樣顆粒(VLPs)和反向遺傳技術建立了NNV顆粒的晶體結構。NNV為無包膜球形,直徑25-30 nm,由一個相對分子質量為42000的單外殼蛋白(CP)和兩個陽性單鏈RNA分子組成。NNV-CP有三個主要結構域:N端臂(N-terminal arm)、殼結構域(S-domain)和突起結構域(P-domain)。三聚體P區在NNV顆粒表面形成60個突起。這些表面突起在病毒感染過程中的抗原性和受體相互作用中起著至關重要的作用。因此,產生NNV中和抗體的表位可以定位在這些突起上。根據抗NNV兔血清的中和試驗,至少報告了三種不同的NNV血清型,根據RNA2可變區的核苷酸序列,NNV被分為四種基因型。
根據NNV基因型,病毒增殖的最適溫度在15~30℃之間,最高溫度在32~35℃之間。這些溫度主要取決于編碼RNA聚合酶的基因組RNA1,盡管編碼CP的基因組RNA2也起著作用。NNV的感染性在37°c時逐漸下降,在≥60°c時急劇下降。這可能是由于NNV表面突起的變性,因為這些突起具有熱敏性構象結構。用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(PH 9.6)處理也容易使它們變性,這表明它們在某些條件下可能特別不穩定。在我們的初步實驗中,我們觀察到培養的NNV懸浮液在中低溫下孵育后,盡管其抗原性保持不變,但感染性逐漸下降。
目前,NNV表面突起、CPs和粒子結構如何被熱處理變性的細節尚不清楚。通過不同溫度處理分析蛋白質結構和功能的變化是一種基本的生化方法。本研究通過研究適度的低溫孵育后NNV感染性和抗原性的變化,分析NNV表面突起的穩定性和游離外殼蛋白(CP)的構象結構。培養的NNV懸液經45℃孵育后,其感染性逐漸下降,但抗原性保持不變;而純化的NNV經45℃孵育后,感染性和抗原性均下降。熱處理后NNV顆粒表面突起完全消失,但病毒顆粒結構保持不變。NNV感染性的降低似乎是由于病毒表面突起的熱變性引起的。與無胎牛血清(FBS)存在條件下的病毒相比,胎牛血清(FBS)可延緩NNV感染性的喪失,表明FBS可作為NNV表面突起構象結構的穩定劑。此外,FBS的穩定功能隨鹽濃度的變化而變化。熱處理后含游離CPs的培養的NNV懸浮液的抗原性可持續維持,表明,與NNV顆粒表面突起結構相比,游離CP突起結構具有更高的熱穩定性。
主要研究結論如下:
1. 不同溫度孵育下培養的NNV懸液的感染性和抗原性              
培養的NNV懸浮液經過熱處理,隨后用去離子水DIW稀釋320倍,然后用NNV抗原固定。培養的NNV懸液(109.3 TCID50/ml) 在25℃、7d內感染滴度穩定。然而,在40℃下孵育的NNV懸液在第7天的感染性逐漸下降到101.2 TCID50/ml,而在45℃、50℃和60℃下孵育的懸液在4、2和0.1天內的感染性分別下降到低于檢測限值(≤100.8TCID50/ml)(圖1A)。ELISA顯示,在溫度≤45℃(0.95±0.03)時,NNV抗原的酶聯免疫吸附值穩定,而在50℃(0.95±0.03)下孵育的NNV抗原在第3天開始逐漸下降,第7天達到0.54。在60℃下孵育的ELISA值在0.1天內急劇下降到0.08(圖1A)。
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圖1.不同賦予溫度對NNV懸液感染性和抗原性的影響。

2. 25℃和45℃孵育下培養的NNV懸液(稀釋320倍)的感染性和抗原性
 用DIW、Tris-Hcl(15 mm,pH 8.0)或PBS將培養的NNV懸浮液預稀釋320倍,并在25 C或45 C下培養7天(圖2)。在45°C孵育后,分別在4、6或7天內,用DIW、Tris-Hcl(15 mm,pH 8.0)或PBS稀釋的培養NNV懸液的感染性逐漸下降到低于檢測限(≤100.8TCID50/ml)的水平(圖2A1)。用L-1510培養基稀釋培養液(A對照)的感染性在3天內也降至檢測限以下。在45°C孵育后,用DIW(0.99±0.03)稀釋的培養懸浮液在實驗期間的酶聯免疫吸附測定值幾乎沒有變化(圖2A2)。而用Tris-Hcl(0.48±0.03)稀釋的NNV懸液ELISA值幾乎是DIW稀釋的一半。用PBS稀釋的NNV懸液在45°C下孵育2天后從0.41降至0.20。此后,未觀察到酶聯免疫吸附測定值的顯著變化(0.22±0.02)(圖2A2)。   
在25℃下孵育后,不管稀釋緩沖液的差異如何,培養懸浮液的感染性是穩定的(圖2B1)。在整個實驗過程中,用DIW稀釋培養液的ELISA值穩定(0.92±0.05)。用Tris-Hcl和PBS(分別為0.44±0.03和0.36±0.02)稀釋的ELISA值幾乎是用DIW稀釋的NNV懸液的一半。這些在實驗期間是穩定的(圖2B2)。
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圖2. DIW, Tris-Hcl, PBS稀釋對培養NNV懸液感染性和抗原性的影響

3. 純化的NNV顆粒在不同緩沖液中的感染性和抗原性            
我們純化了NNV顆粒,以觀察在沒有培養基成分的情況下,溫度如何影響NNV的感染性和抗原性。在45°C下孵育后,不使用懸浮緩沖液的情況下,純化的NNV顆粒的感染性在一天內降低到低于可檢測限值,(圖3A1)。純化的NNV顆粒的ELISA值在半天內也降至≤0.07(圖3A2)。
在25°C下孵育后,無論使用何種懸浮緩沖液,純化的NNV顆粒的感染性和酶聯免疫吸附測定值都是穩定的(圖3B)。先前,我們已經證明,在4°C時,純化的NNV顆粒在PBS中透析后,由于NNV顆粒的逐漸聚集,其抗原性降低。本研究證實,在4°C時,PBS中NNV顆粒的抗原性降低,但在25°C時不降低(數據未顯示)。
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圖3. 用DIW, Tris-Hcl, PBS稀釋純化的NNV顆粒對感染性和抗原性的影響
         
4. 用DIW、Tris-Hcl或PBS將純化的NNV稀釋320倍的影響             
 純化后的NNV顆粒在l-1510培養基中,經DIW、Tris-Hcl(15 mm,PH8.0)或PBS稀釋320倍后,在45°c孵育后,感染性逐漸下降,分別在5、4或3天內達到低于檢測限的水平(圖4A1)。分別從1.0到0.35或從0.6到0.15(圖4A2),DIW或Tris稀釋L-1510培養基中懸浮的純化NNV顆粒的ELISA 測定值逐漸下降,而PBS稀釋L-1510培養基中的NNV顆粒的ELISA 測定值在1天內從0.4下降到0.12(圖4A2)。
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圖4.用DIW, Tris-Hcl, PBS稀釋320倍后,懸浮在L-1510或L-150中的純化NNV顆粒的效果.懸浮在各緩沖液中的純化NNV顆粒在45°C下孵育7天。

5. 從培養基中去除FBS的效果             
 DIW稀釋L-1510培養基(無FBS)中純化的NNV顆粒在45°C孵育后4天內感染性降至檢測限以下,而DIW稀釋L-1510培養基中純化的NNV顆粒在2天內達到檢測限以下(圖4B1)。純化的NNV顆粒在DIW稀釋的l-1510培養基中的ELISA 值逐漸下降,在45℃孵育7天后達到0.41(圖4B2)。在DIW稀釋無FBS培養基中純化的NNV顆粒在45°C孵育1天內從0.75下降到0.20,然后在6天以上孵育后逐漸下降到0.01(圖4B2)。
              
6. 干燥固定對NNV抗原性的影響              
無論培養溫度如何,用Tris-Hcl或PBS稀釋培養的NNV懸液的抗原性幾乎減半(圖2A2,B2)。為了研究鹽濃度對NNV抗原性的影響,將NNV抗原懸浮在不同比例的Tris-Hcl與DIW或PBS與DIW的混合物中進行固定化。用Tris-Hcl(Tris-Hcl:DIW為10:0)或PBS(PBS:DIW為10:0)稀釋培養的NNV懸液的ELISA值分別為0.49或0.42(圖5A)。當Tri-Hcl或PBS的混合比降低(鹽濃度降低)時,這些ELISA值增加到1。對于懸浮在Tris、PBS和DIW稀釋L-1510介質混合物中的純化NNV顆粒,觀察到相同的結果(圖5B)。Tris-或PBS稀釋l-1510(Tris-Hcl:DIW或PBS:DIW,10:0)中NNV顆粒的ELISA值分別為0.41或0.43。當TrI Hcl或PBS的混合比降低(鹽濃度降低)時,這些值增加到1。
相反,對于懸浮在TrI-Hcl、PBS或DIW中的純化NNV顆粒,當懸浮緩沖劑的混合比例改變時,ELISA值沒有顯著變化(圖5C)。結果表明,鹽濃度對NNV顆粒的抗原性沒有影響。然而,在含FBS的L-15稀釋培養基中,無論在45°C下進行熱處理,NNV顆粒和/或游離CPs的抗原性均隨鹽濃度的增加而下降。NNV抗原性下降可能是由于在干固定化過程中NNV抗原的聚集狀態發生了改變,而不是由于熱變性。FBS等培養基成分可能在改變NNV抗原的聚集傾向中起作用。
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圖5. 干燥固定對NNV抗原性的影響

7. 掃描電鏡觀察NNV顆粒表面突起            
  用FIB-SEM對45℃處理24小時或100℃處理5分鐘的純化NNV顆粒的表面結構進行了成像(圖6)。未經熱處理的對照樣品顯示直徑約為30nm的NNV顆粒。此外,在這些表面上可以看到復雜的三維結構(圖6A1-2)。然而,在45°C下孵育24小時(圖6B,C)或100°C下孵育5分鐘(圖6D–F)后,表面形貌完全消失,而具有光滑表面(直徑32–35 nm)的病毒顆粒狀結構可靠地存在,與處理溫度無關。以前有報道稱,NNV顆粒表面突起對病毒抗原性和感染性起著至關重要的作用,并且這些表面突起對熱變性敏感。因此,我們得出結論,我們觀察到的NNV顆粒上的復雜三維結構是表面突起(圖6A1,A2)。這些突出物顯然對熱變性非常敏感,而其余的顆粒結構則特別穩定。
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圖6.聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)觀察NNV顆粒的表面結構。

有趣的是,熱變性NNV粒子的大聚集體被一種薄膜狀結構(圖6C、E、F)覆蓋,用稍強的離子束照射很容易破壞。由于NNV顆粒純度高,不存在形成薄膜狀結構的污染。因此,我們推測這些薄結構可能是樣品冷卻后熱變性突起與鄰近顆粒隨機再折疊形成的。


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